L'insegnamento si propone di fornire agli studenti i fondamenti metodologici delle tecniche biochimiche per l'analisi delle proteine, attraverso un approccio sia teorico che pratico. Nel dettaglio, il corso si propone di fornire le competenze di base sui principi di espressione e purificazione di proteine, sui metodi di quantificazione, di analisi e caratterizzazione delle stesse mediante elettroforesi, cromatografia e spettroscopia. Lo studente acquisirà anche competenze sui principali metodi di analisi “omiche” (proteomica ed interattomica). Inoltre, gli studenti apprenderanno le basi teoriche ed acquisiranno le competenze tecniche relative alle principali banche dati biologiche e all’analisi di sequenze proteiche. Infine, il corso consentirà agli studenti di apprendere come pianificare e realizzare un esperimento scientifico in ambito biochimico, e come interpretare ed analizzare criticamente i risultati ottenuti.
scheda docente materiale didattico
- Le metodologie biochimiche nella ricerca scientifica. Strumentazione di base nel laboratorio di biochimica (vetreria, bilance, agitatori, sistemi termostatati, pHmetri, cappe, centrifughe).
- Volumetria e pesate. Preparazioni di soluzioni, diluizioni, sistemi tampone.
- Produzione di proteine ricombinanti: clonaggio, mutagenesi, sistemi di espressione in batteri, lieviti, cellule di mammifero, cellule di insetto. Proteine di fusione.
- Metodi per la purificazione delle proteine: tecniche di separazione. Estrazione delle proteine dalla fonte biologica. Metodi di frazionamento di miscele proteiche. Omogenizzazione di cellule con potter, ultraturrax, sonicazione, omogenizzatori in continuo a pressione (1° Esperienza di laboratorio).
- Purificazione delle proteine con tecniche cromatografiche: gel filtrazione, cromatografia a scambio ionico, cromatografia di affinità, cromatografia di immunoaffinità, cromatografia per interazioni idrofobiche, cromatografia a fase inversa. Applicazioni dell’HPLC (con esperienza di laboratorio) (2° Esperienza di laboratorio).
- Quantificazione delle proteine. (3° Esperienza di laboratorio)
- Elettroforesi. Elettroforesi su gel di poliacrilammide in condizioni native o denaturanti (SDS-PAGE) tecniche di rivelazione, analisi quantitativa densitometrica delle bande, determinazione del peso molecolare, elettroforesi su gradiente, elettroforesi preparativa, isoelettrofocalizzazione, elettroforesi bidimensionale. (4° Esperienza di laboratorio)
- Tecniche immunochimiche: anticorpi, western blotting, ELISA e RIA, immunoprecipitazione. (5° Esperienza di laboratorio)
- Metodi spettroscopici per lo studio delle proteine. Spettroscopia di assorbimento UV-VIS. Spettroscopia di fluorescenza. Spettroscopia a luce polarizzata. Spettroscopie avanzate. (6° Esperienza di laboratorio)
- Studio degli enzimi e delle proteine. Cinetica enzimatica: calcolo della Km, Ki, Ka. Studio del tipo di inibizione: competitiva, non competitiva, incompetitiva e mista. Uso degli analoghi dei substrati, effetto del pH e della temperatura (7° Esperienza di laboratorio).
- Dosaggio dei metaboliti. Deproteinizzazione acida o basica. Dosaggio di metaboliti con metodi spettrofotometrici, spettrofluorimetrici, Dosaggio ATP, glucosio. Uso dell’HPLC nel dosaggio dei metaboliti.
- Metodi biochimici per l’analisi delle interazioni molecolari. Analisi proteine ligando. Analisi di interazione tra proteine.
-Cristallizzazione di proteine
-Fondamenti di bioinformatica: banche dati biologiche, analisi di sequenze e applicazioni biochimiche
Le esercitazioni di laboratorio sono da considerarsi obbligatorie.
- M.Maccarrone. Metodologie Biochimiche e Biomolecolari, Zanichelli Editore
- Bonaccorsi, Contestabile, Di Salvo. Metodologie biochimiche, Zanichelli Editore.
Le slide di ciascuna lezione saranno rese disponibili.
Programma
Il corso si articolerà in due parti, una teorica e una sperimentale. La prima parte, che si terrà in aula con lezioni frontali sarà dedicata allo studio delle principali metodologie e tecniche utilizzate nei laboratori di biochimica e biologia molecolare. Nella seconda parte, che si terrà in laboratori didattici, verranno svolti esperimenti che riguardano gli argomenti trattati a lezione.- Le metodologie biochimiche nella ricerca scientifica. Strumentazione di base nel laboratorio di biochimica (vetreria, bilance, agitatori, sistemi termostatati, pHmetri, cappe, centrifughe).
- Volumetria e pesate. Preparazioni di soluzioni, diluizioni, sistemi tampone.
- Produzione di proteine ricombinanti: clonaggio, mutagenesi, sistemi di espressione in batteri, lieviti, cellule di mammifero, cellule di insetto. Proteine di fusione.
- Metodi per la purificazione delle proteine: tecniche di separazione. Estrazione delle proteine dalla fonte biologica. Metodi di frazionamento di miscele proteiche. Omogenizzazione di cellule con potter, ultraturrax, sonicazione, omogenizzatori in continuo a pressione (1° Esperienza di laboratorio).
- Purificazione delle proteine con tecniche cromatografiche: gel filtrazione, cromatografia a scambio ionico, cromatografia di affinità, cromatografia di immunoaffinità, cromatografia per interazioni idrofobiche, cromatografia a fase inversa. Applicazioni dell’HPLC (con esperienza di laboratorio) (2° Esperienza di laboratorio).
- Quantificazione delle proteine. (3° Esperienza di laboratorio)
- Elettroforesi. Elettroforesi su gel di poliacrilammide in condizioni native o denaturanti (SDS-PAGE) tecniche di rivelazione, analisi quantitativa densitometrica delle bande, determinazione del peso molecolare, elettroforesi su gradiente, elettroforesi preparativa, isoelettrofocalizzazione, elettroforesi bidimensionale. (4° Esperienza di laboratorio)
- Tecniche immunochimiche: anticorpi, western blotting, ELISA e RIA, immunoprecipitazione. (5° Esperienza di laboratorio)
- Metodi spettroscopici per lo studio delle proteine. Spettroscopia di assorbimento UV-VIS. Spettroscopia di fluorescenza. Spettroscopia a luce polarizzata. Spettroscopie avanzate. (6° Esperienza di laboratorio)
- Studio degli enzimi e delle proteine. Cinetica enzimatica: calcolo della Km, Ki, Ka. Studio del tipo di inibizione: competitiva, non competitiva, incompetitiva e mista. Uso degli analoghi dei substrati, effetto del pH e della temperatura (7° Esperienza di laboratorio).
- Dosaggio dei metaboliti. Deproteinizzazione acida o basica. Dosaggio di metaboliti con metodi spettrofotometrici, spettrofluorimetrici, Dosaggio ATP, glucosio. Uso dell’HPLC nel dosaggio dei metaboliti.
- Metodi biochimici per l’analisi delle interazioni molecolari. Analisi proteine ligando. Analisi di interazione tra proteine.
-Cristallizzazione di proteine
-Fondamenti di bioinformatica: banche dati biologiche, analisi di sequenze e applicazioni biochimiche
Le esercitazioni di laboratorio sono da considerarsi obbligatorie.
Testi Adottati
- Keith Wilson and John Walker: Biochimica e biologia molecolare: principi e tecniche. EDs. 2019 Raffaello Cortina Editore.- M.Maccarrone. Metodologie Biochimiche e Biomolecolari, Zanichelli Editore
- Bonaccorsi, Contestabile, Di Salvo. Metodologie biochimiche, Zanichelli Editore.
Le slide di ciascuna lezione saranno rese disponibili.
Modalità Erogazione
Il Modulo di Metodologie Biochimiche (Prof.ssa Alessandra di Masi) si articola in 3 CFU di didattica frontale e 1.5 CFU di esercitazioni. La didattica frontale avviene mediante l'utilizzo di presentazioni power point e potrà essere erogata sia in presenza che su piattaforma telematica dipendentemente dalla situazione pandemica. Le esercitazioni di laboratorio saranno svolte tutte in presenza.Modalità Frequenza
Frequenza NON obbligatoria per le lezioni frontali in aula. Frequenza obbligatoria ad almeno il 75% delle esercitazioni di laboratorio.Modalità Valutazione
L'esame finale si articola in due prove: 1) Prova scritta, da svolgersi in aula nella data prevista per l'appello d'esame, costituita da 20 domande a risposta multipla e 2 domande a risposta aperta. 2) Presentazione orale, da svolgersi mediante supporto PowerPoint, avente per oggetto un articolo scientifico assegnato dal docente e riguardante una o più tecniche biochimiche trattate nel corso di Metodologie Biochimiche. Nel corso della presentazione, lo studente dovrà illustrare il quesito scientifico affrontato nello studio, descrivere come i ricercatori abbiano utilizzato le tecniche biochimiche per rispondere a tale quesito e discutere criticamente i risultati ottenuti. Dovrà inoltre evidenziare i punti di forza e i limiti delle metodologie impiegate, confrontandole, ove opportuno, con altri approcci sperimentali presentati durante il corso. La discussione potrà essere integrata da domande del docente finalizzate ad approfondire la conoscenza delle metodologie biochimiche e la capacità dello studente di valutarne criticamente l'applicabilità. Il voto finale sarà determinato dalla media aritmetica dei voti conseguiti nelle due prove. La valutazione terrà conto dei seguenti criteri: -appropriatezza, correttezza e completezza delle conoscenze e delle competenze acquisite; -utilizzo corretto del linguaggio scientifico e della terminologia disciplinare; -chiarezza espositiva e capacità comunicativa; -capacità di ragionamento e di analisi critica; -capacità di sintesi; -capacità di integrare e collegare i diversi argomenti trattati nel corso. L'esito dell'esame sarà attribuito secondo la seguente scala di valutazione: 18–20/30: Sufficiente 21–23/30: Discreto 24–26/30: Buono 27–29/30: Ottimo 30/30: Eccellente 30/30 e lode: Eccellente con lode, attribuita agli studenti che dimostrino una preparazione particolarmente approfondita, eccellenti capacità di analisi critica e padronanza della disciplina.