L'insegnamento si propone di fornire agli studenti i fondamenti metodologici delle tecniche biochimiche e bioinformatiche per l'analisi delle proteine, attraverso un approccio sia teorico che pratico. Nel dettaglio, il corso si propone di fornire le competenze di base sui principi di espressione e purificazione di proteine, sui metodi di quantificazione, di analisi e caratterizzazione delle stesse mediante elettroforesi, cromatografia e spettroscopia. Lo studente acquisirà anche competenze sui principali metodi di analisi “omiche” (proteomica ed interattomica). Inoltre, gli studenti apprenderanno le basi teoriche ed acquisiranno le competenze tecniche relative alle principali metodologie bioinformatiche di analisi e manipolazione di sequenze e strutture proteiche. Infine, il corso consentirà agli studenti di apprendere come pianificare e realizzare un esperimento scientifico in ambito biochimico, e come interpretare ed analizzare criticamente i risultati ottenuti.
scheda docente materiale didattico
- Le metodologie biochimiche nella ricerca scientifica. Strumentazione di base nel laboratorio di biochimica (vetreria, bilance, agitatori, sistemi termostatati, pHmetri, cappe, centrifughe).
- Volumetria e pesate. Preparazioni di soluzioni, diluizioni, sistemi tampone.
- Produzione di proteine ricombinanti: clonaggio, mutagenesi, sistemi di espressione in batteri, lieviti, cellule di mammifero, cellule di insetto. Proteine di fusione.
- Metodi per la purificazione delle proteine: tecniche di separazione. Estrazione delle proteine dalla fonte biologica. Metodi di frazionamento di miscele proteiche. Omogenizzazione di cellule con potter, ultraturrax, sonicazione, omogenizzatori in continuo a pressione (1° Esperienza di laboratorio).
- Purificazione delle proteine con tecniche cromatografiche: gel filtrazione, cromatografia a scambio ionico, cromatografia di affinità, cromatografia di immunoaffinità, cromatografia per interazioni idrofobiche, cromatografia a fase inversa. Applicazioni dell’HPLC (con esperienza di laboratorio) (2° Esperienza di laboratorio).
- Quantificazione delle proteine. (3° Esperienza di laboratorio)
- Elettroforesi. Elettroforesi su gel di poliacrilammide in condizioni native o denaturanti (SDS-PAGE) tecniche di rivelazione, analisi quantitativa densitometrica delle bande, determinazione del peso molecolare, elettroforesi su gradiente, elettroforesi preparativa, isoelettrofocalizzazione, elettroforesi bidimensionale. (4° Esperienza di laboratorio)
- Tecniche immunochimiche: anticorpi, western blotting, ELISA e RIA, immunoprecipitazione. (5° Esperienza di laboratorio)
- Metodi spettroscopici per lo studio delle proteine. Spettroscopia di assorbimento UV-VIS. Spettroscopia di fluorescenza. Spettroscopia a luce polarizzata. Spettroscopie avanzate. (6° Esperienza di laboratorio)
- Studio degli enzimi e delle proteine. Cinetica enzimatica: calcolo della Km, Ki, Ka. Studio del tipo di inibizione: competitiva, non competitiva, incompetitiva e mista. Uso degli analoghi dei substrati, effetto del pH e della temperatura (7° Esperienza di laboratorio).
- Dosaggio dei metaboliti. Deproteinizzazione acida o basica. Dosaggio di metaboliti con metodi spettrofotometrici, spettrofluorimetrici, Dosaggio ATP, glucosio. Uso dell’HPLC nel dosaggio dei metaboliti.
- Metodi biochimici per l’analisi delle interazioni molecolari. Analisi proteine ligando. Analisi di interazione tra proteine.
- M.Maccarrone. Metodologie Biochimiche e Biomolecolari, Zanichelli Editore
- Bonaccorsi, Contestabile, Di Salvo. Metodologie biochimiche, Zanichelli Editore.
Le slide di ciascuna lezione saranno rese disponibili.
Mutuazione: 20410601 Laboratorio di metodologie biochimiche e bioinformatiche in Biologia per la ricerca molecolare, cellulare e fisiopatologica LM-6 DI MASI ALESSANDRA, POLTICELLI FABIO, De Simone Giovanna
Programma
Modulo di Metodologie Biochimiche (Prof.ssa Alessandra di Masi)- Le metodologie biochimiche nella ricerca scientifica. Strumentazione di base nel laboratorio di biochimica (vetreria, bilance, agitatori, sistemi termostatati, pHmetri, cappe, centrifughe).
- Volumetria e pesate. Preparazioni di soluzioni, diluizioni, sistemi tampone.
- Produzione di proteine ricombinanti: clonaggio, mutagenesi, sistemi di espressione in batteri, lieviti, cellule di mammifero, cellule di insetto. Proteine di fusione.
- Metodi per la purificazione delle proteine: tecniche di separazione. Estrazione delle proteine dalla fonte biologica. Metodi di frazionamento di miscele proteiche. Omogenizzazione di cellule con potter, ultraturrax, sonicazione, omogenizzatori in continuo a pressione (1° Esperienza di laboratorio).
- Purificazione delle proteine con tecniche cromatografiche: gel filtrazione, cromatografia a scambio ionico, cromatografia di affinità, cromatografia di immunoaffinità, cromatografia per interazioni idrofobiche, cromatografia a fase inversa. Applicazioni dell’HPLC (con esperienza di laboratorio) (2° Esperienza di laboratorio).
- Quantificazione delle proteine. (3° Esperienza di laboratorio)
- Elettroforesi. Elettroforesi su gel di poliacrilammide in condizioni native o denaturanti (SDS-PAGE) tecniche di rivelazione, analisi quantitativa densitometrica delle bande, determinazione del peso molecolare, elettroforesi su gradiente, elettroforesi preparativa, isoelettrofocalizzazione, elettroforesi bidimensionale. (4° Esperienza di laboratorio)
- Tecniche immunochimiche: anticorpi, western blotting, ELISA e RIA, immunoprecipitazione. (5° Esperienza di laboratorio)
- Metodi spettroscopici per lo studio delle proteine. Spettroscopia di assorbimento UV-VIS. Spettroscopia di fluorescenza. Spettroscopia a luce polarizzata. Spettroscopie avanzate. (6° Esperienza di laboratorio)
- Studio degli enzimi e delle proteine. Cinetica enzimatica: calcolo della Km, Ki, Ka. Studio del tipo di inibizione: competitiva, non competitiva, incompetitiva e mista. Uso degli analoghi dei substrati, effetto del pH e della temperatura (7° Esperienza di laboratorio).
- Dosaggio dei metaboliti. Deproteinizzazione acida o basica. Dosaggio di metaboliti con metodi spettrofotometrici, spettrofluorimetrici, Dosaggio ATP, glucosio. Uso dell’HPLC nel dosaggio dei metaboliti.
- Metodi biochimici per l’analisi delle interazioni molecolari. Analisi proteine ligando. Analisi di interazione tra proteine.
Testi Adottati
- Keith Wilson and John Walker: Biochimica e biologia molecolare: principi e tecniche. EDs. 2019 Raffaello Cortina Editore.- M.Maccarrone. Metodologie Biochimiche e Biomolecolari, Zanichelli Editore
- Bonaccorsi, Contestabile, Di Salvo. Metodologie biochimiche, Zanichelli Editore.
Le slide di ciascuna lezione saranno rese disponibili.
Modalità Erogazione
Il Modulo di Metodologie Biochimiche (Prof.ssa Alessandra di Masi) si articola in 3 CFU di didattica frontale e 1.5 CFU di esercitazioni. La didattica frontale avviene mediante l'utilizzo di presentazioni power point e potrà essere erogata sia in presenza che su piattaforma telematica dipendentemente dalla situazione pandemica. Le esercitazioni di laboratorio saranno svolte tutte in presenza.Modalità Valutazione
L'esame consisterà in un test a risposta multipla che si svolgerà in aula il giorno dell'appello di esame. Questo esame scritto dovrà essere integrato come segue: 1. mediante una relazione scritta circa l'attività svolta nel modulo di Bioinformatica (Prof. Fabio Polticelli), secondo le modalità concordate con il docente; 2. con una breve presentazione in aula di massimo 10 minuti, mediante l'utilizzo del programma Power Point. La presentazione orale verterà su un articolo scientifico su tecniche biochimiche illustrate durante il modulo di Metodologie Biochimiche (Prof.ssa Alessandra di Masi) e sarà assegnato dal docente. Lo studente dovrà di illustrare come i ricercatori abbiamo utilizzato la/le tecnica/tecniche biochimiche per rispondere ad un quesito scientifico. Sarà anche compito dello stdudente discutere circa le potenzialità e i limiti delle tecniche utilizzate, e per questo motivo, nel corso della presentazione, è possibile che vengano discussi insieme al docente anche anche altri approcci metodologici illustrati durante il corso. Il voto finale sarà dato dalla media dei voti ottenuti nel corso delle tre prove sopra elencate. Il voto finale valuterà i seguenti parametri: a) Appropriatezza, correttezza e congruenza delle conoscenze e competenze acquisite; b) Utilizzo appropriato del linguaggio specifico della disciplina; c) Capacità espressiva; d) Capacità logiche; e) Capacità di sintesi; f) Capacità di collegare differenti argomenti. Di conseguenza, il giudizio potrà essere: a) Sufficiente (da 18 a 20/30) b) Discreto (da 21 a 23) c) Buono (da 24 a 26) d) Ottimo (da 27 a 29) e) Eccellente (30) scheda docente materiale didattico
- Programmi di allineamento di sequenze e di ricerche di omologia in banche dati
- Modellistica molecolare
- Docking molecolare
Mutuazione: 20410601 Laboratorio di metodologie biochimiche e bioinformatiche in Biologia per la ricerca molecolare, cellulare e fisiopatologica LM-6 DI MASI ALESSANDRA, POLTICELLI FABIO, De Simone Giovanna
Programma
- Le banche dati bibliografiche e biologiche- Programmi di allineamento di sequenze e di ricerche di omologia in banche dati
- Modellistica molecolare
- Docking molecolare
Testi Adottati
Tramontano, Bioinformatica, ZanichelliModalità Erogazione
Questo modulo del corso prevede quattro ore di lezioni frontali e dieci ore di esercitazioni pratiche in laboratorio informaticoModalità Valutazione
La valutazione avverrà sulla base di una relazione sulle attività pratiche svolte dagli studenti e di un esame orale scheda docente materiale didattico
Mutuazione: 20410601 Laboratorio di metodologie biochimiche e bioinformatiche in Biologia per la ricerca molecolare, cellulare e fisiopatologica LM-6 DI MASI ALESSANDRA, POLTICELLI FABIO, De Simone Giovanna